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东南仪诚谈聚丙烯酰胺凝胶(蛋白类)

2023年01月27日 11:28:08      来源:北京东南仪诚实验室设备有限公司广州分公司 >> 进入该公司展台      阅读量:8

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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:

1仪器:垂直系列电泳槽;低、中、高压电源;恒温循环器

2试剂:丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、考马斯亮蓝、凝胶缓冲液、非变性上样缓冲液、Tris碱、等

聚丙烯酰胺凝胶电泳

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1仪器:垂直系列电泳槽;低、中压电源、恒温循环器2试剂:丙烯酰胺、N,N’-甲叉双丙烯酰胺,SDS(十二烷基硫酸钠)溶液、1.5MTris-HCl(pH8.8)、0.5MTris-HCl(pH6.8)、TEMED、10%(w/v)过硫酸胺溶液、SDS-Page上样缓冲液:(0.5M Tris(pH6.8)缓冲液、甘油、10%SDS、二硫苏糖醇、溴酚蓝)、Tris、、SDS、考马斯亮蓝等

SDS-Page,在蛋白质裂解液中加入SDS和疏基乙醇或DTT

巯基乙醇或DTT可使蛋白质分子中二硫键还原,使多肽分成单个亚单位。


PAGE据其有无浓缩效应,分为连续系统与不连续系统

连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷及分子筛效应;不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具有浓缩效应,故分离效果更好。不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质,利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性,使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带,然后进行分离。

样品浓缩效应

1)凝胶孔径的不连续性:浓缩胶为大孔胶;分离胶为小孔胶。在电场作用下,样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小,移动速度快;当进入小孔胶时,受到的阻力大,移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处,样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

2)电位梯度的不连续性:电泳开始后,快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区,使局部电位梯度增高,将蛋白质浓缩成狭窄的区带

缓冲体系离子成分及pH值的不连续性

Tris:缓冲配对离子,维持溶液的电中性及pH值Cl-:在电场中迁移率快,前导离子(leading ion),快离子。Gly:其pI=6.0,在pH6.8的浓缩胶缓冲体系中,解离度很小,因而在电场中迁移很慢,称为尾随离子(trailing ion),慢离子。当进入pH8.8的分离胶时,解离度增加,其有效迁移率超过蛋白质;因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。高电势梯度不存在了,各种蛋白质仅会由于其分子量或构型的不同,在一个均一的电势梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程度不同,表现的泳动率的不同被分开大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷,在电场中,都向正极移动。
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