用TS-8对人肝星状细胞HSC-LX2增殖分析

1 材料 

1.1 仪器 

2001HY-6003 型 CO2细胞培养箱、902 型－80 ℃冰箱（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；全波段多功能酶标仪、Universal HoodⅡ型成像分析仪（美国 Bio-Tek公司）；PHS-25型数显台式pH计（上海越平科学仪器有限公司）；CP124C 型电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]；Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机（美国Eppendorf公司）；BD FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）；TS-8型转移脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Promo Vert型倒置显微镜[成贯仪器（上海）有限公司]；SW-CJ-2D 型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；LDZX-50FBS型灭菌锅（上海申安厂）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；ZHWY-103D型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；K30型干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）；Step OnePlusTM型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Applied Biosystems公司）；XH-B型旋涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）。 

1.2 药品与试剂 

原碱由廖尚高教授课题组提供，高效液相色谱法（HPLC）和核磁共振检测纯度均在95％以上；磷酸盐缓冲液（PBS粉末，无锡傲锐东源生物科技有限公司，自配，pH 7.2～7.4，质量浓度：11.74 μg/mL）；RPMI-1640培养基、0.25％（美国Gibco公司，批号：8117293、1967534）；胎牛血清（美国ScienCell公司，批号：23954）。

2 方法 

2.1 原碱溶液的制备 

用 DMSO 溶解原碱，制成浓度为 100 mmol/L的母溶液（现配现用），0.22 μm的微孔滤膜滤过除菌。 

2.2 细胞培养 

HSC-LX2细胞使用含有10％胎牛血清及100 u/mL和100 μg /mL的1640高糖培养基于37 ℃、5％CO2培养箱中培养，每24 h换一次液，待细胞融合至80％～90％时传代培养，取对数生长期细胞用于试验。 

2.3 MTT法检测HSC-LX2细胞的增殖抑制率 

取对数生长期的HSC-LX2细胞，以0.2 ％消化，以离心半径 4 cm（下同）、1 000 r/min 离心 5 min，收集细胞，用含10％胎牛血清1640培养液混悬细胞，以5×104mL－1的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，边缘用 200 μL 无菌的 PBS 填充以防干燥，置于37 ℃、5％ CO2细胞培养箱中放置贴壁。再将HSC-LX2细胞随机分为对照组、DMSO组和不同浓度的原碱组（25、50、100、200、400、500 μmol/L），每组 6 个复孔。轻轻吸弃原培养孔中的培养液，对照组加入含5％胎牛血清1640培养基100 μL，DMSO组加入含5‰DMSO的1640 培养基 100 μL，原碱组分别加入 25、50、100、200、400、500 μmol/L原碱的含5％胎牛血清1640培养基100 μL。‘’

3 结果 

3.1 细胞增殖抑制率 

与对照组比较，DMSO组细胞的OD值无明显变化（P＞0.05），50、100、200、400、500 μmol/L 原碱组细胞的OD值均明显减小，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。随着原碱浓度的增加，细胞的OD值逐渐减小。

3.2 细胞凋亡率 

与对照组比较，中、高浓度原碱组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

4 讨论 

肝纤维化是一种慢性、进行性、弥漫性的肝病理生理现象，属可逆病变。近年来的研究发现，尽管不同病因导致肝纤维化的机制不同，但均具有一个共同点，即都有HSCs的参与，HSCs是纤维化反应的重要效应器和细胞因子的主要来源和靶点 。

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