光学显微镜发展的里程碑

Milestone #1 光学显微镜的发明

，英国物理学家罗伯特虎克(Robert Hooke)在1665年发表了本关于光学显微镜的书《显微图谱》(Micrographia)，书中有各种生物样品的手工绘图，影响甚广。更为重要的是，这是次展示了光学显微镜对于科学研究的重要作用。另一位对于早期显微镜发展有很大贡献的是荷兰商人与科学家安东尼·范·列文虎克(Antonie van Leeuwenhoek)，他一生中制作出超过500种简单显微镜，可以观察到1微米大小的样品。列文虎克首先观察并描述了单细胞生物，他的成就是改进了光学显微镜并建立了微生物学。

Milestone #2 染色技术和荧光染料

追溯到1858年，德国解剖学教授Joseph von Gerlach发现了不同细胞器在相同稀释溶液中被染色的程度是有不同的。1873年，意大利医生与科学家卡米洛·高尔基(Camillo Golgi)发明了高尔基复合体镀银染色法，在生命科学领域通用至今。以上的染色方法是通过改变样品的光学吸收属性，从而实现不同结构之间产生一定的对比度；荧光染色则从理论上可以实现更多更复杂的对比度。德国有机化学家阿道夫·冯·拜耳(Adolf von Baeyer)在1871年合成了荧光染料fluorescein，而在1882年德国免疫学家Paul Ehrlich则次将它应用在动物生理学研究上。很快地在台荧光显微镜发明不久，Stanislav von Provazek于1914年次将它应用在细胞生物学上。

Milestone #3 光学分辨率的极限

1835年英国数学家与天文学家乔治·艾里(George Airy)首先提出了，经过透镜之后光线的衍射图案会形成一个艾里斑(Airy Disc)。恩斯特·阿贝在他1873年的文章里，提到了传统光学显微镜的最小分辨距离不会小于成像光波长的一半。在他后续的研究文章里，详细地用数字公式解释了这些参数之间的关系。

Milestone #4 荧光显微镜

物理学家Oskar Heimstädt在1911年成功地搭建并使用了台荧光显微镜，为了降低背景噪声信号，他采用暗场聚光镜照明的方式来提高图像的对比度。这种透射荧光的方式有很多局限，所以初期荧光显微镜的应用不广。1929年德国药物学家Philipp Ellinger和解剖学家August Hirt设计了台落射荧光显微镜的原型机，他们称之为活体显微镜(intravital microscopy)，他们用这台显微镜成像注射了荧光染料fluorescein和trypaflavin的肾脏和肝脏组织。荧光显微镜另外一个重大的技术进步是1967年二色分光镜(dichromatic beamsplitter)的发明，荷兰科学家Johan Sebastiaan Ploem采用一块放置45度角的二色镜，将波长较短的光反射到样品上，激发的荧光波长较长则会穿过同一块二色镜，到达目镜。二色镜的出现将落射式荧光显微镜从专业仪器变成了桌面型通用仪器。

Milestone #5 相差显微镜

1930年荷兰物理学家Frits Zernike发明了相差显微成像技术，改变了生物科学家们观察细胞的方式，Zernike也因此获得了1953年诺贝尔物理学奖。相差技术可以在无需染色的情况下观察到透明的样本，Zernike认识到这项技术的重要性，非常兴奋地演示相差成像技术给显微镜厂商卡尔蔡司。可惜地是，厂商初期对于这项技术没有很大的兴趣，直到过了10年各大显微镜厂商才开始生产相差显微配件。

Milestone #6 观察亚细胞结构

直到1950年代，科学家们才通过光学显微镜观察到细胞内的亚细胞结构。1937年W. J. Schmidt在发育中的海胆卵中观察到纺锤体的纤维化结构，同时在1939年他用一台偏振光显微镜也能重复相同结果。尽管Schmidt看到了橄榄球状的纺锤体，但他的显微镜分辨率不够，看不到清晰的丝状结构。1953年Shinya Inoué在普利斯顿大学搭建了一台改进型偏光显微镜，可以观察到微弱的细胞内双折射物质。有了这台仪器，他能记录活体细胞中纺锤体的细微结构，并且在细胞分裂周期里追踪它的动态变化。相比较荧光显微镜，偏光显微镜的优势是无需标记，这个技术后来在人工生殖（体外受精）过程中观察卵细胞非常有帮助。

Milestone #7 荧光抗体的广泛利用

Albert Coons在1961年的一次学术会议上提到“荧光抗体的时代已经到来”，从那之后的几十年，免疫荧光标记已是细胞生物学领域的一个金标准。基本的思路是，生物样品先用一抗标记，然后用带有荧光的二抗去标记一抗，这样就可以特异性地标记出不同的细胞结构（下图）。

Milestone #8 通过干涉原理来提高图像对比度DIC

在1950年代，法国物理学家Georges Nomarski提出并解释了微分干涉（DIC）的理论基础，并且改进了Wollaston棱镜提出了Nomarski棱镜，可以将这块棱镜置于焦面以外的地方。相比较1930年底出现的相差成像技术，DIC技术的优势是分辨率更高、类似三维的效果、没有相差的光晕问题。1969年Nomarski等人又阐述了DIC的应用前景，随后这项技术被显微厂商蔡司正式商业化。

Milestone #9 只见树木不见森林Confocal

在1960年底，共聚焦Confocal的给了哈佛大学的科学家Marvin Minsky，在这之后捷克斯洛伐克布拉格Charles大学的Mojmir Petrán与耶鲁大学的David Egger和Robert Galambos合作开发了一款小型化针孔扫描显微镜。1967年Petrán和Egger报道了采用这套设备的反射光光路成像了无标记脑与神经节细胞的图像。

Milestone #10 测量细胞内部的动态过程FCS/FRAP

荧光技术发展以来，被广泛应用于各种显微成像领域，但是基本上都是局限于静态图像。1972年康奈尔大学Webb实验室将荧光显微镜应用于化学或生物反应动力学，此项技术后来称为fluorescence correlation spectroscopy (FCS)，常见的就是蛋白与蛋白相互作用的实验。在1990年，结合共聚焦技术，瑞典Karolinska Institutet的科学家Rigler和Widengren将FCS技术提高到单分子水平。1997年德国马普生化研究所的Petra Schwille提出了FCCS技术并用于双色单分子动态检测。FCS可以用于浓度较低、变化较快的样品，另一项技术fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) 即荧光漂白后恢复技术更适合于荧光标记浓度较高、动态变化较慢的样品，比如细胞膜蛋白。

Milestone #11 荧光共振能量转移技术FRET

这项技术Förster resonance energy transfer (FRET)最初是在1940年由德国物理化学家Theodor Förster提出的，donor荧光团如果靠近acceptor荧光团，电子激发能量将有一部分被转移被激发acceptor荧光团。在1967年FRET理论由Lubert Stryer和Richard Haugland通过实验验证了。从原理上看，FRET也非常适合用于细胞内蛋白与蛋白的相互作用的成像实验，因为细胞内的蛋白可以靠得很近。直到1990年代中期，结合改进的荧光显微镜和共聚焦技术，FRET才在细胞生物学领域得到广泛重视和应用。1995年荧光寿命成像FLIM结合FRET技术，能够极大避免荧光漂白对于FRET结果的影响。

Milestone #12 备受关注的钙离子成像

2008年诺贝尔化学奖获得者Roger Tsien除了对于GFP的重大贡献之外，还开创了一个非常有影响力的方向，那就是钙离子成像。在他1980年的论文里就提到了钙离子的重要性，1985年他和同事合成了六种新的钙离子染料，其中两种广泛使用至今，即Fura-2和Indo-1。但是对于Fura-2这个染料有个缺点就是需要用UV紫外光去激发，其实需要快速切换波长。1989年Roger Tsien和同事又开发了非比例成像的钙离子染料，即Fluo-2和Fluo-3，这些染料可以用可见光激发，而且不需要切换激发波长。合成钙离子染料这项技术，又极大促进了显微成像领域的高速相机、电动荧光转轮、多波长荧光光源这些硬件的发展。

Milestone #13 全内反射荧光成像TIRF

全内反射荧光成像TIRF技术通过改变入射光的角度，形成100nm-200nm左右厚度的消逝波场，从而达到非常高的Z轴分辨率。1981年Axelrod首先验证并观察到了细胞局部的粘附现象；1990年底Yanagida和同事采用TIRF技术在溶液中实现单分子检测，他们在1995年又观察到了单个肌球蛋白分子的动态。

Milestone #14 反卷积软件技术

1983年，Agard and Sedat将反卷积引入细胞生物学和显微成像领域。1989年Fay和同事将迭代运算引入反卷积算法中。更新信息可以参加前期公众号文章反卷积能取代共聚焦吗？

Milestone #15 双光子显微成像技术

双光子吸收效应在量子光学领域是一个历史悠久的理论，1931年由Maria
Göppert-Mayer在她的博士论文中提出。直到1990年底，锁模激光器的出现才有可能通过实验验证双光子吸收现象。在这一时期，康奈尔大学Webb实验室是个使用双光子显微成像技术来观察活细胞中的染色体；而1994年从这个实验室出来的德国科学家Winfried Denk将双光子技术应用在神经科学领域。之后，美国科学家Karel Svoboda在1997年成功用双光子成像了整体小鼠脑中的神经细胞。时至今日，双光子显微系统在神经科学领域有了极大的发展，近年来，光遗传光刺激也更多地和双光子技术结合，广泛地应用于在体清醒小动物。更多技术细节，请参考往期热文“双光子比共聚焦更好吗”

Milestone #16 光片(Light Sheet)成像技术

在发育生物学，科学家们观察胚胎并成像的时候，的挑战是三维分辨率和光毒性。传统共聚焦技术在Z轴方向的分辨率有先天的不足，同时由于是点扫描的方式来成像，光毒性不可避免地存在于实验过程中。光片技术的特点是照明光轴和检测光轴是垂直的！更多技术细节，请参考往期热文“Lattice light-sheet microscopy”

垂直显微照明的概念是在1903年提出的；直到1993年Voie等人才定制了这样的显微镜，他们旋转荧光样品、在不同角度采集一系列图像、然后重建三维荧光图像。2004年德国科学家Ernst Stelzer和他的团队改进了并将这个技术应用在活体斑马鱼胚胎样品上，并命名为SPIM；2008年这个团队用优化版SPIM系统，观察了24小时斑马鱼胚胎的发育过程，并追踪了每个细胞核，从而得到了一整幅细胞分裂细胞迁移的全景图。

Milestone #17 单分子荧光检测

单分子荧光检测最初的尝试发生在1976年，但是有各种技术壁垒等待突破。1993年，Eric Betzig和Robert Chichester在室温下采用近场扫描光学显微镜实现重复性的单分子检测；1995年Toshio Yanagida和同事采用改进型全内反射荧光成像TIRF技术检测到了荧光标记的肌动蛋白单分子。从此之后，很多荧光单分子检测都是使用了TIRF光学方法。

Milestone #18 绿色荧光蛋白GFP

2008年诺贝尔化学奖授予Osamu Shimomura、Martin Chalfie和Roger Tsien三位科学家，以表彰他们在发现和发展绿色荧光蛋白方面做出的贡献。1962年Shimomura和同事发现了GFP，很多年之后在1992年Prasher克隆了GFP基因，而1994年Chalfie和其团队发现了GFP基因表达在细菌里也能发荧光。在这之后，Roger Tsien团队工程化了GFP，使其发光更亮、更稳定、更符合传统荧光光源；同时他们团队也在此基础上开发了各种颜色的荧光蛋白，广泛而持久地应用在细胞生物学领域。

Milestone #19 基因编码的荧光探针

在GFP发展之后，越来越多的科学家专注于将这样可以在体内表达的荧光探针用于各种显微成像实验，包括钙离子成像。这样，不需要无机分子来标记钙离子了，更适合在体实验。

Milestone #20 红色荧光蛋白RFP和光活化GFP

1999年个红色荧光蛋白DsRed被克隆出来，并被用于双色荧光成像。三年之后，Patterson等人做成了个光活化(Photoactivatable) GFP，之后十年见证了这个蛋白在超高分辨率实验里的特殊用途。这个光活化GFP只有在405紫外光照射之后，才能增强发出绿色荧光。

Milestone #21 超高分辨显微技术

德国马普研究所科学家Stefan Hell发明并改进了stimulated emission-depletion (STED) 显微技术，光学分辨率可以达到100nm以下。Mats Gustafsson及其团队采用结构照明技术 structured illumination microscopy (SIM)可以在XY方向改善光学分辨率，达到120 - 150nm左右。Eric Betzig之后发展的photoactivated localization microscopy (PALM) 技术、以及哈佛大学庄小威教授的stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) 技术，都可以将分辨率提高到20-30nm，但是对于生物样品的荧光标记有较高要求。

参考文献：
/milestones/milelight/timeline.html